细胞冻存是一种用于低温保存细胞的方法，旨在长期维持细胞的活性和功能。这一技术对于细胞系的长期储存、实验的重复性、基因库存的建立及细胞治疗的储备等方面都具有重要意义。通过精确的冻存过程，可以有效减少在细胞传代过程中可能出现的遗传变异，同时避免因污染、环境变化或实验操作失误导致的细胞损失。最佳的冷冻保存时机是选择细胞生长速度最旺盛的时期。

冷冻保护剂是细胞冻存过程中的核心成分。常用的冷冻保护剂包括二甲基亚砜（DMSO）和甘油等。这些保护剂的主要功能是降低溶液的冰点，减少冰晶的形成，从而有效保护细胞免受冰晶的机械损害。虽然DMSO适用于大部分细胞类型，但对于某些细胞，DMSO可能具有一定的敏感性，此时可以使用甘油作为替代选项。

第1阶段：冷冻保存实验步骤

1. 在冷冻管上标记日期、研究人员姓名、细胞编号、传代数和细胞类型等信息。

2. 对于贴壁细胞，首先去除细胞培养基，使用PBS清洗，然后添加适量的胰蛋白酶覆盖细胞，放入37°C的培养箱中孵育约2分钟（具体时间根据细胞类型调整）。随即加入等量的培养基停止消化，用移液枪轻轻吹打细胞，将其转移至50mL Falcon管中。

3. 对于悬浮培养的细胞，直接将所需体积的细胞转移至50mL Falcon管中。

4. 使用血细胞计数器计数细胞活力，确保冷冻前活力至少达到75%。

5. 在室温下以300×g离心5分钟，并去除上清液。

6. 准备冷冻培养基（见表1），在加入前确保混合均匀并加热至37°C，所需成分包括DMSO等冷冻保护剂，防止形成有害细胞内外的冰晶。

7. 加入冻存培养基至所需细胞密度，通常为1×10⁶/mL。在室温下，细胞在冻存液中的时间不应超过10分钟。

8. 将1mL的样品分装入冷冻管中，盖紧盖子，然后将冷冻管转移至室温的冷冻盒中，再放入-80°C冰箱。可在冷冻盒外添加适量的异丙醇，确保温度以每分钟1°C的速度稳定下降，以防止细胞内冰晶的形成。

9. 约24小时后，从冷冻盒中取出冷冻管并转移至液氮中进行长期储存。一般情况下，细胞可以在液氮中保存数年，而不应在-80°C下长时间存放，以避免对细胞活力的损害。

第2阶段：解冻冷冻细胞系实验步骤

1. 从液氮储存器中取出冷冻管，并快速放入37°C水浴中，直至解冻约80%（此过程不应超过1分钟）。避免在室温下解冻，以减少对细胞的损伤。

2. 使用移液器将冷冻管中的物质转移到含有约10mL预热培养基的15mL Falcon管中。

3. 以300×g离心5分钟，弃去上清液，然后用适量的培养基重悬细胞沉淀。

4. 将细胞悬液转移到培养容器中，并置于37°C培养箱中培养。

通过上述步骤，细胞冻存和解冻的过程将有效帮助实验研究，确保细胞在未来的应用中保持优良的活性和功能。同时，使用尊龙凯时提供的高质量产品和服务，可以进一步提升细胞研究的效率和效果。