双抗体夹心法是检测生物体内抗原的常用方法，操作步骤如下：

一、制备固相抗体

首先，将特异性抗体与固相载体结合，形成固相抗体，并通过洗涤步骤去除未结合的抗体及杂质。

二、添加受检标本

接下来，将待检样本加入，确保其与固相抗体接触反应一定时间，使样本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原复合物。随后，再次洗涤以去除其它未结合的物质。

三、引入酶标抗体

第三步是添加酶标抗体，使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体，此时固相载体上的酶量与样本中的抗原量呈正相关。

四、加入底物

最后，加入底物，夹心复合物中的酶将催化底物生成有色产物。根据颜色反应的强度，即可对该抗原进行定性或定量分析。

抗体检测应用

利用相同的原理，我们可以制备固相抗原和酶标抗原结合物，从而利用双抗原夹心法进行抗体的测定。在临床检验中，这种方法适用于检测多种蛋白质等大分子抗原，如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只需获取针对特定抗原的异性抗体，即可用其包被固相载体并制备酶结合物以建立此检测方法。

检验中的注意事项

在一步法测定中，当样本中受检抗原的浓度很高时，可能出现与固相抗体及酶标抗体结合，而不形成夹心复合物的情况。这类似于沉淀反应中抗原过量导致的效应，反应后显色的吸光值可能与标准曲线的某一抗原浓度吸光值相同，可能造成低于实际值的读取，这种现象被称为钩状效应（hook effect）。在检测如血清中HBsAg、AFP以及尿液中hCG时，应特别关注可测范围的最高值。

如果待测分子的不同位点存在多个相同决定簇，例如HBsAg的α决定簇，则可用针对该决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。在HBsAg的检测中，特别要注意其亚型，HBsAg包括adr、adw、ayr和ayw四种亚型，每一种亚型均对相同α决定簇具有反应性，这也是在使用单抗夹心法时需要谨慎考虑的因素。

类风湿因子（RF）的干扰

使用双抗体夹心法测抗原时，还需注意类风湿因子（RF）的干扰。RF是一种自身抗体，主要为IgM型，能够与多种动物IgG的Fc段结合。如果在血清标本中存在RF，它可能会伪装成抗原，与固相抗体和酶标抗体结合，从而导致假阳性反应。采用F(ab')或Fab片段作为酶结合物可以消除RF的干扰，因此，双抗体夹心法ELISA试剂在使用时需评估是否受到RF影响，此项评估已成为此类试剂的重要考核指标。

适用范围

总体而言，双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，而不适用于小分子单价抗原或半抗原，因为后者无法形成有效的夹心结构。

与双抗体夹心法的反应模式相似，某些检测方法通过特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法不同的是，此法以酶标抗原替代酶标抗体，受检标本无需稀释即可直接用于测定，因而敏感度通常高于间接法。这种方法在检测乙肝标志物中抗HBs时尤为常见。方法的关键在于酶标抗原的制备，根据抗原结构的不同选择合适的标记方式。使用尊龙凯时品牌的产品，可以提高检测的准确性和可靠性。