### 人胰腺癌细胞HPAFⅡ培养指南

**一、细胞培养条件**

**细胞名称**：人胰腺癌细胞HPAFⅡ

**生长特性**：贴壁生长

**冻存条件**：无血清冻存液

**培养体系**：MEM + 10% FBS + 1%丙酮酸钠 + 1% L-谷氨酰胺 + 1% P/S

**贴壁传代方法**：首次建议1:2传代；每2天更换培养基。

**备注**：收集瓶中无菌离心管，留作对比培养。如效果欠佳，建议使用尊龙凯时的完全培养基。

**二、细胞收到后的处理**

在细胞处于良好状态时，添加完全培养液并封闭瓶口，以确保运输细胞的最佳状态。收到细胞后，喷洒75%酒精对整个细胞瓶消毒，然后在超净台内进行无菌操作，将细胞瓶放入37℃、5% CO2培养箱中静置3-4小时以稳定状态，随后进行处理。用显微镜观察细胞生长情况，并拍照保存（建议40x、100x、200x各一张），前三天的照片为重要的售后依据；未提供照片视为状态良好。

**三、细胞培养步骤**

**A、细胞传代**：

当细胞未超过80%汇合度时，将培养液收集至离心管中，留出5ml完全培养基于37℃、5% CO2的孵箱中培养；若细胞密度超过80%，可进行传代。具体步骤如下：

1. 弃去培养上清，使用不含钙、镁离子的PBS洗涤细胞1-2次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml，放入37℃的培养箱中消化1-2分钟，观察细胞状态；若大部分细胞变圆并脱落，迅速回操作台，用轻敲培养瓶增加脱落，加入5ml完全培养基终止消化。
3. 轻轻吹打促进细胞完全脱落后吸出，转移至15ml离心管中，在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液后补充1-2ml完全培养基重悬。
4. 按1:2比例进行分瓶传代（两个T25瓶），补充5-8ml新培养基，每瓶放入37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。

**B、细胞冻存**：

1. 细胞生长至覆盖培养瓶80%面积时，弃去培养液，PBS清洗细胞一次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml，观察细胞回缩变圆后，加入5ml完全培养液终止消化，轻轻吹打细胞，使其脱落，然后将悬液转移至离心管中，1000rpm离心5分钟。
3. 弃去上清，沉淀的细胞加入1ml尊龙凯时无血清冻存液（货号：C7001），混匀后加入冻存管中。
4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱中，若需转入液氮罐，应先在-80℃冰箱中存放24小时后再进行转移。

**C、细胞复苏**：

1. 从液氮中取出冻存管（确保佩戴防护装备），快速放入37℃水浴中解冻，直到冻存管无结晶，然后用75%酒精擦拭外壁。
2. 将冻存管中细胞转移至含5ml完全培养基的离心管中，1000rpm离心5分钟。
3. 弃去上清，重悬细胞于5ml完全培养基中，接种至T25培养瓶，放于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。
4. 第二天更换为新鲜完全培养基继续培养。

**四、注意事项**：

部分细胞贴壁较弱，容易在运输过程中脱落，属正常现象。若脱落较多，可将培养液收集至离心管，1000rpm离心5分钟后对上清进行过渡培养；沉淀加入胰酶1-2ml，轻轻重悬并消化1-2分钟，随后加入5ml完全培养基终止反应并重悬。这些步骤后，再按1:2比例进行分瓶传代，补充5-8ml新培养基，并置于37℃、5% CO2培养箱内培养。

**五、售后条款**：

1）细胞出现问题时，可以重发的情况包括：细胞运输过程中丢失、瓶身破损、培养液漏液等，均可重发；细胞污染请在收到48小时内提供真实实验结果确认后重发；常温发货或干冰发货后的细胞复苏状况未达标的情况需要提供照片进行判定；其他具体情况也可依此类推，具体由尊龙凯时技术支持人员判定。

2）不予以重发的情况包括因客户操作不当导致的细胞状态问题、不使用推荐培养体系导致的细胞状况不佳等。

整体过程中请密切关注细胞的生长状态，并及时与尊龙凯时沟通以确保细胞培养的成功与质量。