ELISA（酶联免疫吸附试验）是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种重要的免疫学技术，广泛应用于抗原或抗体浓度的检测。在ELISA实验中，显色反应是关键步骤，它通过酶催化无色底物生成有色产物，温度和反应时间对显色效果有显著影响。在设定时间内，阴性孔保持无色，而阳性孔能随着时间的延长而增强色泽，适当提高温度能够加速显色的进程。对于定量分析，加入底物后的温度和时间必须严格遵循预定条件，定性分析则允许在室温下进行，反应时间也可适当调整。

在使用OPD底物时，一般于室温或37℃反应20至30分钟后，显色不会进一步加深，若延长反应时间可能会导致背景值上升。值得注意的是，OPD底物液在光照下会自行变色，因此显色反应应在避光条件下进行，并在显色结束时加入终止液。使用硫酸终止反应后，显色由橙黄色转变为棕黄色。

TMB底物受光照的影响较小，可在室温下观察反应结果。不过，为了确保实验结果的稳定性，建议在规定时间内读取结果。经HRP作用后，TMB的显色通常在约40分钟后达到最大，随后会逐渐减弱，2小时后可退色至无色。TMB的终止液种类繁多，例如叠氮钠和十二烷基硫酸钠（SDS）等酶抑制剂可有效终止反应，并使蓝色维持12至24小时不褪色，非常适合目视判断。此外，酸性终止液会导致蓝色变为黄色，此时可在特定波长（450nm）下测定吸光值。

在检测过程中，被测标本中的抗原与固相载体表面的抗体进行反应，随后加入酶标记的抗体，经过洗涤后形成结合。加入底物后，酶催化底物生成的有色产物量与标本中抗原的浓度直接相关，由此可通过显色的深浅进行定性或定量分析。ELISA是生物医学研究中最常用的实验手段之一，然而在实验过程中可能会遇到各种问题，以下是对ELISA实验中标曲和样本显色问题的解析：

问题一：标曲不显色或显色很弱

这种情况可能由于标准品溶解不足或倍比稀释时未充分涡旋引起。充分的涡旋震荡可以确保标准品的完全溶解和混合，简单依靠移液器反复吹打效率低且效果不佳。

问题二：标曲和样本均不显色

若在孵育阶段静置在桌面上，抗原与抗体之间的接触效果会受到影响，导致显色偏弱。建议使用ELISA专用的微孔板振荡器，以提高抗原与抗体的结合效果。此外，也有可能因为漏加某个组分导致结果不明显，新手应做好标记和记录，或使用具添加染料的ELISA试剂盒。

问题三：标曲显色，样本不显色

许多人可能将该问题误认为与试剂盒有关，但实际上这是一个误区。ELISA的灵敏度依赖于样本中靶蛋白的浓度及其干扰因素。虽然ELISA是蛋白检测中灵敏度最高的方法，与信号增强剂结合后的高敏ELISA，以及其他类型如化学发光ELISA、荧光法检测的ELISA、免疫PCR等技术使灵敏度进一步提升，但在目标蛋白浓度极低时仍可能无法检测到。针对这类样本，可以尝试高敏ELISA，其效果在提升可测率的同时，若结果位于标准范围内则相对可信。需要注意的是，某些声称高敏ELISA的产品可能仅通过提高抗体浓度，而未应用信号增强技术，灵敏度提升有限。

问题四：标曲和样本都显色，但复孔的CV大

此问题通常与移液器的使用及实验者的操作习惯相关。若移液器维护不规范，会导致显著的误差。建议熟悉移液器的正确使用和维护，还可通过空白板练习移液动作，以提高精确度。同时应注意加样的一致性，减少操作时的时间差异。

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