细胞复苏的成功与否与冻存及复苏操作密切相关。上周我们讨论了在细胞冻存过程中常见的错误，相关内容可以参考《细胞复苏失败原因分析——冻存篇》。本篇文章将从复苏的角度分析和排查复苏过程中可能出现的问题。

复苏步骤回顾

在开始之前，我们先复习一下细胞复苏的基本步骤：

1. 提前将水浴锅预热至37℃，同时对培养基进行复温，并设置好离心机的转速。
2. 准备一个15ml的离心管并加入适量的培养基。
3. 取出冻存管，立即将其浸入水浴锅中，并迅速摇晃，使细胞在2分钟内充分融化。
4. 将细胞悬液缓慢滴入预先添加了培养基的离心管中，进行1000rpm的离心3分钟。
5. 弃去上清液，重悬细胞并接种至培养器皿中，随后放入培养箱。

复苏过程中常见错误

以下是一些复苏过程中常见的错误操作：

1. 如果液氮或冰箱与水浴锅距离较远，未做保冷措施，细胞在运输过程中可能开始融化（尤其在夏季）。冻存细胞应放在干冰或冰盒上运输至水浴锅。
2. 在运输冻存管时，切勿用手直接触碰细胞部分或将其放在口袋中。应握住管盖或放在合适的容器中运输，避免因手的温度升高而导致细胞融化。
3. 使用错误的方法融化细胞，比如用手捂热。这种方式无法提供足够的温度，且会导致细胞受热不均匀，从而增加细胞死亡的风险。
4. 在水浴过程中未严格控制融化时间，直接放入水中静置，而不加以摇晃，容易导致活率下降。建议在2分钟内快速融化，并通过摇晃促进细胞融化，切忌将冻存管静置于水浴中。
5. 如果在水浴结束时管内仍有较大冰块尚未融化，会对细胞造成损害。冰块中的细胞升温过慢会导致死亡，而已融化的细胞也可能因冰块影响受到低温损伤。若2分钟内融化困难，可将水浴温度提高到39℃并加快摇动速度，必要时可以将冻存管放入一次性PE手套中以防污染。
6. 细胞融化后未进行离心去除DMSO，一些复苏细胞会在融化后直接加入10倍培养基稀释而不离心。虽然这种方法对于好养的贴壁细胞可能有效，但对悬浮细胞则不适用，且DMSO具有一定的毒性，尤其对特定细胞（如HL-60细胞）影响显著。若不确定自己的细胞对DMSO的敏感性，建议选择离心去除上清以确保安全。

以上内容结合了尊龙凯时的多年经验与冻存知识，基本能够解决大部分复苏失败的问题。如有其他相关知识点，欢迎同学们在评论区补充！